Sophie av Mecklenburg-Güstrow föddes i Wismar som dotter till hertig Ulrik III av Mecklenburg-Güstrow och prinsessan Elisabeth av Danmark. Hennes bakgrund förankrade henne stadigt i den nordiska furstevärlden under tidig modern tid.

År 1572 ingick hon äktenskap med konung Frederik II av Danmark på Köpenhamn. Genom detta giftermål blev hon drottning av Danmark och Norge och fick stor betydelse för det kungliga hovets kulturella och politiska liv under slutet av 1500-talet.

Som drottning deltog hon aktivt i förvaltningen av sina förläningar och visade stort intresse för ekonomi, trädgårdskonst och astrologi. Hon underhöll kontakter med tidens lärda kretsar och beskyddade bland annat astronomen Tycho Brahe.

Efter sin makes död 1588 drogs hon in i politiska strider om förmyndarstyrelsen för sin son, den blivande Christian IV av Danmark. Konflikterna ledde till att hon sedermera tvingades dra sig tillbaka till Nyköpings sluth i hertigdömet Schleswig.

Under sitt senare liv ägnade hon sig åt godsförvaltning och filantropisk verksamhet. Hon gynnade kyrkor och skolor samt lånade upprepade gånger ut betydande summor till den danska kronan under dess krigshandlingar.

Sophie av Mecklenburg-Güstrow avled 1631 på Nyköpingshus i det danska hertigdömet Schleswig. Hennes kvarlevor fördes senare till Roskilde domkyrka där hon vilar i samma gravkor som sin gemål.